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DiBAC4（3）是一種敏感的慢反應(yīng)探針，用于測量細胞膜電位。通常，慢反應(yīng)探針顯示其跨膜分布的潛在依賴性變化，伴隨熒光變化。
它們的光學(xué)響應(yīng)的??幅度遠大于快速響應(yīng)探針的幅度（通常每mV的熒光變化為1％）。包括陽離子羰花青，羅丹明和陰離子氧雜菁的慢
反應(yīng)探針適用于檢測由呼吸活動，離子通道滲透性，藥物結(jié)合和其他因素引起的非激發(fā)細胞的平均膜電位的變化
光譜圖：
操作步驟

1.準備細胞：

1.1對于貼壁細胞：在生長培養(yǎng)基中將細胞以40,000至80,000個細胞/孔/100μL在96孔板中培養(yǎng)過夜，或?qū)τ?84孔板以10,000至20,000個細胞/孔/25μL。

1.2對于非貼壁細胞：從培養(yǎng)基中離心細胞，然后將細胞沉淀懸浮于等量的HHBS和MP染料加載溶液（參見下面的步驟2.2），125,000至250,000細胞/孔/100μL，96-以及聚賴氨酸d板或30,000至60,000個細胞/孔/25μL的用于384孔聚賴氨酸d板。在實驗之前，在制動器關(guān)閉的情況下以800rpm 離心板2分鐘。

注意：每個細胞系應(yīng)在個人基礎(chǔ)上進行評估，以確定最佳的細胞密度為細胞內(nèi)鈣動員。

2.準備DiSBAC2（3）染料加載溶液（1板）：

2.1在高質(zhì)量無水DMSO中制備10至30 mM的DiSBAC2（3）原液。應(yīng)及時使用原液; 任何剩余的溶液需要被等分并冷凍在< -20℃。

注意：避免反復(fù)凍融循環(huán)，避免光照。

2.2準備 2X DiSBAC2(3) 染料加載溶液：在實驗當天，將 DiSBAC2(3) 固體溶解在 DMSO 中，或?qū)?DiSBAC2(3) 原液的等分試樣解凍至室溫。在 Hanks 和 20 mM Hepes 緩沖液 (HHBS) 或您選擇的緩沖液（pH 7，含 0.04% 至 0.08% Pluronic? F-127（貨號#20053）和 2 mM臺盼紅 0.1M水溶液）中制備 2X 工作溶液，濃度為 20 至 40 μM （Cat.# 2456）混合均勻。該工作溶液在室溫下至少穩(wěn)定 2 小時。

3.運行膜電位測定：

3.1將100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）DiSBAC2（3）染料加載溶液（來自步驟2.2）加入細胞板中。

注1：如果您的篩選化合物干擾g rowth培養(yǎng)基和血清因子，在添加DiSBAC2（3）染料加載 溶液之前，用等體積的HHBS緩沖液替換生長培養(yǎng)基?；蛘撸毎梢栽跓o血清條件下生長。

注2：染料加載后不要洗滌細胞。

3.2將染料加載板在細胞培養(yǎng)箱中孵育30至60分鐘。

注意：在室溫下孵育30至60分鐘可能會更好。

3.3使用HHBS或所需的緩沖液制備復(fù)合板。

3.4通過監(jiān)測Ex / Em = 540 / 590nm處的熒光強度（Cat＃21414）進行膜電位測定。

注意：在實驗之前運行信號測試很重要。不同的儀器有自己的強度范圍。將信號測試強度調(diào)整到最大儀器強度計數(shù)的10％至15％的水平。例如，F(xiàn)LIPR-384的最大熒光強度計數(shù)為65,000，因此應(yīng)調(diào)整儀器設(shè)置以使其信號測試強度在7,000到10,000左右。